اثر آنتی بادی اختصاصی Igy بر کاهش کلونیزاسیون کلستریدیوم پرفرجنس در دستگاه گوارش جوجه های گوشتی
گردآورنده: دکتر مهین رحیمی
بیماری های دستگاه گوارش در جوجه های گوشتی شامل: نکروتیک، انترایتیس، التهاب روده ای ویروسی، کوکسیدیوز و سندرم ها شامل سوء جذب و دیسبیوزیس به چندین دلیل مورد توجه جهانی قرار گرفته اند. اول: تراکم بالای مکان های پرورش که باعث می شود پاتوژن های دفع شده از دستگاه گوارش به سرعت پخش شوند. دوم: به دلیل بهبود ژنتیکی جوجه های گوشتی بطور مطلوبی غذا را به وزن بدن تبدیل می کنند و دستگاه گوارش این پرندگان در جذب مواد غذایی بسیار کار آمد است.. سوم: میکروارگانیسم های دستگاه گوارش که نقش اساسی در تخریب ترکیبات غذایی دارند و رابطه ی پیچیده ای که بین باکتری های دستگاه گوارش و باکتری های موکوسی وجود دارد و می تواند بسته به ترکیب میکروبی برای میزبان مفید یا مضر باشد.
نکروتیک انترایتیس یک بیماری مهم در طیور است و باعث کاهش بازده غذا و نرخ رشد می شود. به دلیل این که این بیماری منجر به خسارت اقتصادی شدیدی در صنعت طیور می شود، همان طور که گفته شد از جمله بیماری هایی است که توجه زیادی بر لزوم پیشگیری و درمان آن متمرکز شده است. نکروتیک انترایتیس به وسیله کلستریدیوم پرفرجنس یک باسیل بی هوازی گرم مثبت که تشکیل اسپور میدهد ایجاد می شود. این باکتری به طور معمول بخشی جمعیت میکروبی دستگاه گوارش حیوانات و انسان می باشد ور در خاک و فاضلاب حیوانات مزرعه نیز وجود دارد، و به عنوان یک پاتوژن روده ای مورد توجه است. در درمان های دامپزشکی کلستریدیوم عمدتا مسئول بیماری های روده ای است اما بیماری زایی فاکتورهای مستعد کننده معمولا بین میزبان های مختلف متفاوت است. معمولا در انسان و حیوانات ایجاد گانگرن گاز و بیماری هایی با منشا غذایی می کند. C.Perfringens در دمای 15 تا 50 درجه سانتیگراد رشد می کند و هنگامی که به شکل اسپور است دمای 100 درجه را به مدت 2 ساعت تحمل می کند، بنابراین تهیه غذای طیور عاری از اسپور با روش های استاندارد بسیار سخت است.
معمولا جوجه هایی که CP در فلور طبیعی نداشته باشند وجود ندارند، اگرچه تعداد آن ها به طور بسیار گسترده ای متغیر گزارش شده است، به نظر می رسد که بیماری زمانی اتفاق می افتد که CP که یک بخش طبیعی از فلور روده ای است در روده کوچک بیش از حد رشد کرده و تولید سموم خارج سلولی کند. در ایجاد NE به صورت آزمایشگاهی نیز مشاهده ش که مقدار C.Perfringens به طور مثبتی در ارتباط با شدت ضایعات NE می باشد.در این مورد Kaldhusdel و همکاران نیز در سال 1999 نشان دادند که تمام نمونه های روده ای مبتلا به NE در هر گرم محتویات مدفوع مقداری بیشتر از log10 6 باکتری دارد که حاکی از سطوح بالای کلونیزاسیون C.Perfringens می باشد. اگر چه تعداد بسیار زیاد CP برای ایجاد بیماری NE کافی نمی باشد. به هر حال مشاهده شده که روده پرندگان تحت تاثیر NE دارای تعداد بسیار زیادی CP CFU 106-108 در هر گرم مدفوع می باشد.
اولین بار نکروتیک انترایتیس در سال 1961 توسط Parish از یک گله 6 تا 7 هفته ای خروس ها در انگلستان گزارش شد و او این بیماری را انتروتوکسمیا ناشی از (C.Perfringens) Closstridium iwelchii توصیف کرد، از آن زمان یکی از مهمترین بیماری های جوجه گوشتی در کشورهای مختلف جهان شده است. Smith (1971) نیز بیان داشت که C.iwelchii ارتباط بسیار مهمی با نکروتیک انترایتیس در جوجه ها دارد. به طور کلی بیماری هایی که به وسیله کلستریدیوم پرفرجنس ایجاد می شوند انتروتوکسمیا نامیده می شوند، به دلیل اینکه توکسین های ترشح شده در روده احتمالا به داخل جریان عمومی خون جذب می شوند. این بیماری در تمام طول سال اتفاق می افتد، ولی بیشتر در طی ماه های جولای، اگوست، سپتامبر و اکتبر رایج است و معمولا در یک فارم بیش از یک بار در سال اتفاق می افتد. عوامل مستعد کننده می تواند شامل تغییر ناگهانی در غذا و یا بیماری های سرکوب کننده سیستم ایمنی، کوکسیدیوز که می تواند موجب تخریب پوشش اندوتلیوم و قرار گرفتن دیواره روده در معرض لومن شود، سطوح بالای پروتئین، فیبر و یا جیره های بر پایه گندم باشد.
کلستریدیاها بیشترین تعداد سموم را در بین گونه های باکتریایی تولید می کنند و در بین کلستریدیاها، کلستریدیوم پرفرجنس بیشترین سم را تولید می کند، همچنین این باکتری بسیار پراکنده است و همان طور که گفته شد بعنوان بخشی از جمعیت میکروبی حیوانات و انسان و همچنین در خاک نیز یافت می شود. سم های ترشح شده از C.Perfringens عامل اصلی تاثیرگذار بر صنعت طیور است. CP بیش از 17 سم خارج سلولی مختلف ترشح می کند که 4 سم از این سموم (α،β،i،ε) عمده سموم کشنده موکوسی هستند که باکتری ها بر اساس آن به 5 نوع زیستی بسته به نوع سم تولیدی گروه بندی می شوند: نوع A: آلفا، نوع B: آلفا با بتا و اپسیلون، نوع C: آلفا و بتا و نوع D: آلفا با اپسیلون و نوع E: آلفا با ایوتا.
هر نوع توکسین بیماری زایی متفاوتی را در انسان و حیوان ایجاد میکند. بیماری NE غالبا به وسیله نوع A کلستریدیوم و به میزان کمتر به وسیله نوع C ایجاد می شود. گزارش شده که سم خام ایجاد ضایعات می کند و با NE در پرندگان جرم فری که سم به وسیله آنتی CPA سرمی خنثی شده قابل مقایسه است. آلفا توکسین ممکن است به جریان خون دسترسی پیدا کند و منجر به بیماری های کلینیکی و در بعضی موارد مرگ می شود.
این بیماری در جوجه ها، پولت های بوقلمون، اردک های اهلی، جوجه شترمرغ و قو و اردک وحشی مشاهده می شود. نکروتیک انترایتیس کلینیکی معمولا در جوجه گوشتی و پولت های بوقلمون اتفاق می افتد اما شاید در مرغ های مادر جوان و مرغان تخمگذار که روی بستر نگهداری می شوند نیز مشاهده شود.
علایم کلینیکی
بیماری به طور گسترده بیشتر در جوجه های گوشتی اتفاق می افتد. چندین نویسنده گزارش کردند که بیشتر در سنین 2 تا 6 هفته رایج است، اما Bamford و Nairn (1967) متوجه این شرایط در جوجه های با 7 هفته سن و Helmboldt و Bryant (1971)، NE را در پرندگان با سن بالاتر از 11 هفته مشاهده نمودند. داده هایی برای مرگ و میر در دسترس نیست، به دلیل اینکه پرندگان گله بیمار سریع تلف می شوند. پرندگان بیمار افسرده، با پرهای ژولیده و معمولا در نزدیکی منبع گرما تجمع یافته، در مراحل پیشرفته دچار لنگش شده روی زمین می افتند، هنگام برداشتن آنها از زمین آب از دهان آنها جاری می شود و چینه دان با گاز و مایعات متسع شده است. در این حالت پرنده معمولاظرف چند ساعت می میرد، نکروز کبد نیز مشاهده می شود اما باکتری ها در بافت های این بخش مشاهده نمی شوند. در آزمایشات هیستوپاتولوژی ضایعات روده ای شامل: نکروتیک و التهاب روده و در لومن روده کوچک مخلوطی از سلول های اپیتلیال مرده که در فیبرین تجمع یافته اند مشاهده می شود، کلونیزاسیون باکتری ها خصوصا باکتری های گرم مثبت رایج است. نوک ویلی ها تخریب می شود، لامینا پروپریا دارای تعداد متوسطی از سلول های فاگوسیت کننده غیر گرانولوسیتی است. CP همچنین ممکن است سبب عفونت های تحت حاد در روده و کبد، نکروتیک انترایتیس تحت حاد و تورم کبد شود. در مرغ های تخمگذار جوان یک بیماری با ضایعات سنگدان گزارش شده است که به CP نسبت داده می شود. ضایعات مشابه در جوجه گوشتی و پولت های بوقلمون مشاهده شده است و در جوجه گوشتی CP در این ضایعات رشد یافته بود. شیوع حاد معمولا در جوجه های گوشتی و بوقلمون ها در سن 2 هفتگی اتفاق می افتد، ولی به میزان کمتری در گله های بالای 7 هفته مشاهده میشود. مرگ و میر متغیر است، اما حدود یک درصد در هر روز در طی یک هفته معمولا در گله رایج است. علایم بیماری معمولا افسردگی، بی اشتهایی و مرگ سریع می باشد. در شیوع حاد، اسهال به ندرت دیده می شود اما در پرندگانی که بیشتر مصون مانده اند شاید دیده شود.علایم کلینیکی متغیر است و نکروتیک انترایتیس ملایم رایج تر از فرم کلینیکی بیماری است. اگرچه علایم کلینیکی ملایم و تحت کلینیکی بیماری کمتر ظاهر می شود اما تاثیر بر عملکرد تولید احتمالا قابل توجه می باشد.فرسایش سنگدان تقریبا در همان سنی که ضایعات روده اتفاق می افتد در جوجه های گوشتی که از نظر کلینیکی سالم هستند مشاهده می شود.یک ضایعه معمولی در جوجه های بیمار به صورت یک نکروز شدید و گسترده موکوسی در روده کوچک ظاهر می شود نکروتیک انترایتیس تحت حاد به وسیله زخم های کانونی ونکروز در موکوس پیشین روده کوچک تشخیص داده می شود. NE در جوجه های گوشتی از سن 1 تا 2 هفتگی تا زمان کشتار مشاهده می شود. بیش از 80 درصد پرندگان مورد مطالعه در گاه های تحت تاثیر احتمالا ضایعات معمولی در روده کوچک دارند. هزینه ای که NE یک گله حتی در حالت تحت درمانی ایجاد می کند 7 سنت به ازای هر پرنده می باشد. در سال 1995 NE عامل 56 درصد از خسارات در انگلستان بود و به طور کلی منجر به تحمیل بیش از 2 بیلیون دلار در هر سال به هزینه های تولید در سطح جهان می شود. استراتژی های کنترل NE شامل حداقل کردن قرار گرفتن در معرض عوامل ایجاد کننده خطر (جیره، کیفیت بستر و کوکسیدیوز) و استفاده از عوامل ضد میکروبی درمانی و یا پیشگیری کننده که کارایی مناسبی در مقابل CP نشان داده اند، می باشد. برای دهه ها ترکیبات ضد میکروبی مانند ویرجینامایسین، اویلامایسین و باسیتراسین به طور گسترده به منظور تولید جوجه گوشتی و همچنین جلوگیری از NE و بهبود عملکرد مورد استفاده قرر گرفته اند.
در دو دهه اخیر بسیاری از جنبه های استفاده از ترکیبات ضد میکروبی مانند استفاده تحت درمانی طولانی مدت در محیط های پرورش متراکم حیوانات به عنوان عامل ایجاد کننده و گسترش دهنده مقاومت باکتریایی شناسایی شد. شواهد حاصل از بسیاری از مطالعات نشان میدهد که باکتری ها ژن های مقاومت به آنتی بیوتیک را حمل میکنند که میتوانند از حیوانات به انسان منتقل شوند. بر اساس این نتایج و در راستای ایجاد قوانین احتیاطی اتحادیه اروپا استفاده از محرک های رشد آنتی بیوتیکی را در غذای حیوانات در سال 2006 ممنوع کرد. به علاوه سازمان بهداشت جهانی در سال 2014 به این نتیجه رسید که استفاده از افزودنی های غذایی به صورت مکمل در غذای حیوانات مزرعه یک موصوع بهداشت عمومی است و یک برنامه فوری جهانی به منظور کاهش استفاده از این ترکیبات لازم می باشد. فشارهایی از طرف کمیته های پزشکی و دامپزشکی و سازمان نظارتی و مصرف کنندگان به منظور کاهش یا حذف آنتی بیوتیک ها از غذای حیوانات به وجود آمده است. استفاده از آنتی بیوتیک های محرک رشد احتمالا در آینده محدودتر میشود. این شرایط چالش بسیار بزرگی را در صنعت طیور ایجاد میکند و منجر به وقوع بیشتر بسیاری از بیماری ها از جمله نکروتیک انترایتیس میشود. به عنوان مثال افزایش شیوع NE به خصوص در غرب اروپا مشاهده شد. در فرانسه به عنوان مثال وقوع NE از 4 درصد در سال 1995 به 12/4 درصد در سال 1999 افزایش یافت. بنابراین کمیته های علمی در صدد شناسایی جایگزین های جدید برای آنتی بیوتیک به منظور بهبود عملکرد پرندگان و همچنین جلوگیری از گسترش باکتری های زئونوتیک که برای سلامت انسان مهم می باشند، هستند. بعضی از محصولات جایگزین مانند اسیدهای آلی، گیاهان دارویی، پروبیوتیک و پری بیوتیک ها در درمان این بیماری ها به طور متغیری موثر میباشند، ولی هیچکدام از این جایگزین ها به اندازه آنتی بیوتیک های محرک رشد در حفظ بازده تولید بالا و کنترل نکروتیک انترایتیس (ناشی از کوکسیدیا) موثر نبودند.
ایمنی درمانی خوراکی (ایمنی غیر فعال) با استفاده آنتی بادی ها اخیرا توجه زیادی به خود جلب کرده و به نظر می رسد به دلیل اختصاصی بودن، این رهیافت جایگزین موثری برای آنتی بیوتیک ها باشد. تعداد زیادی از محققان مدارکی مبنب بر اثرات مفید درمانی آنتی بادی های منوکلنال و پلی کلنال طیور (مرغ، اردک و بلدرچین) تهیه کرده اند. اعمال خوراکی آنتی بادی ها از سرم پستانداران و کلستروم حتی آنتی بادی های مونوکلنال نیز با موفقیت انجام شده است. به طور کلی میتوان گفت ایجاد ایمنی غیر فعال بر اساس آنتی بادی ها برای جلوگیری و درمان بیماری های عفونی مفید است و در آن توانایی مقدار زیادی از یک آنتی بادی اختصاصی عامل کلیدی است.
ایمنوگلوبولین Y عمده آنتی بادی است که در طیور (Gallus domesticus) تولید میشود. بعد از بازآرایی ژن V-C در Bسل ها Igy به طور مداوم سنتز و به داخل جریان خون ترشح و از آنجا به زرده منتقل میشود. Igy تولید شده در نتاج در مقابل پاتوژن های پرندگان ایجاد ایمنی هومورال میکند تا زمانی که بلوغ سیستم ایمنی کامل شود. در واقع ایمنوگلوبولین ها از پلاسمای پرندگان از طریق گیرنده های Igy که در کیسه زرده پرندگان یافت میشود به زرده تخم مرغ منتقل میشوند و بنابراین در فرزندان ایجاد ایمنی غیرفعال می کنند. به طور مقایسه ای این نقش به پلاسنتا یا IgG کلستروم در پستانداران ارتباط داده میشود. بنابراین تخم مرغ مرغ های ایمن شده، اقتصادی و منبع فراوانی از آنتی بادی پلی کلنال هست. Igy میتواند به راحتی تولید و با بازده بالایی از زرده ها با روش های مختلف به عنوان روش های ارزان و مطمئن تلخیص شود و به منظور کنترل و جلوگیری از عفونت های ویروسی و باکتریایی در حیوانات مزرعه استفاده گردد.
نخستین بار Klempere و همکاران در سال (1983) وجود ایمنی اکتسابی از نوع غیر فعال را با بیان انتقال ایمنی در برابر سم تتانوس از مرغ به جوجه های حاصل از آن را اثبات کردند. ادامه تحقبقات توسط Ruddiger Schad و همکارانش صورت گرفت و توانستند با انجام آزمایش های مختلف به نتایجی همچون ساختار، میزان آنتی بادی تولیدی و روش تولید بپردازند و در انتها مراحل اجرایی کار به صورت پروتکل جامعی عرضه شد. Marco Cesar این نوع آنتی بادی را به عنوان ابزاری جهت تشخیص مدفوعی پارو و ویروس سگ معرفی کرد، متعاقب آن ویروس هاری و باکتری سالمونلا توسط این روش تشخیص داده شد و بعد از آن روشی برای جلوگیری از انتشار سالمونلا توسط رحیمی و همکاران (1387) معرفی گردید. همچنین رحیمی و همکاران نشان دادند که IgY ضد H9N2 نه تنها در درمان بیماری بسیار موثر است بلکه انتقال این ویروس را نیز کاهش میدهد. در این میان آزمایش هایی بر روی هلیکوباکتری پیلور عامل موثر زخم معده انجام گرفت که توانستند با موفقیت اتصال باکتری به جدار روده را مهار کنند.
مزایای ایمنوگلوبولین Y
استفاده از جوجه ها برای تولید آنتی بادی پلی کلنال مزایای بسیاری نسبت به نوع پستانداری آن دارد. مهمتریت مزیت جمع آوری آنتی-بادی ها به روش غیر تهاجمی است. در مقابل روش های رایج که حیوانات به منظور جمع آوری مقدار کافی خون برای به دست آوردن آنتی بادی قربانی می شوند، تولید آنتی بادی در مرغ های تخمگذار تنها به جمع آوری تخم مرغ ها نیازمند است و تولید تیتر در جوجه ها به مقدار زیاد و به مدت طولانی نیاز به تزریق های تقویت کننده مداوم را کاهش میدهد. مزیت دیگر ناشی از فاصله فیلوژنیک بین ماکیان و پستانداران است. جوجه ها معمولا در تولید آنتی بادی ها علیه پروتئین های پستانداری محافظت شده نسبت به پستانداران بسیار موفق ترند و به منظور تحریک سیستم ایمنی به میزان کافی نیاز بسیار کمتری به آنتی ژن وجود دارد. در مقایسه آنتی بادی ها در گونه های مختلف حیوانات، یک بار ایمن سازی در مرغ، اویدیتی ( قدرت اتصال آنتی بادی آنتی ژن) معادل اویدیتی حاصل از چهار بار ایمن سازی در گوسفند را موجب میشود. در پاسخ ایمنی سازی مضاعف ماهانه میزان تولید آنتی بادی اختصاصی در گوسفند ده برابر مرغ خواهد بود که احتمالا علت آن تفاوت در سایز حیوانات و تفاوت در نیمه عمر آنتی بادی های تولیدی میباشد، اما در هر حال ویژگی اویدیتی آنتی بادی در مرغ بالاست.
همانطور که گفته شد پرندگان نیز مانند پستانداران در نتایج خود با آنتی بادی ایجاد ایمنیت می کنند، بنابراین مقدار IgY زرده برابر و حتی بالاتر از سرم مرغ است. در واقع یک مرغ می تواند به عنوان یک کارخانه کوچک تولید آنتی بادی در نطر گرفته شود. یک مرغ معمولا در سال حدود 300 تخم می گذارد و یک زرده محتوی 100-50 میلی گرم IgY و 10-2 درصد از یک آنتی بادی اختصاصی می باشد. بنابراین یک مرغ ایمن شده بیشتر از 22500 ملی گرم IgY در هر سال تولید میکند که معادل تولید 3/4 خرگوش در یک دوره بیش از یک ساله است. مزیت کمی IgY به وسیله Gottstein و Hemmeler مشخص شد که نشان داد مقدار IgY در یک ماه 18 برابر IgG تولید شده در خرگوش است.
همچنین هزینه نگهداری مرغ ها پایین تر از پستاندارانی مثل خرگوش است. بنابراین زرده تخم مرغ یم منبع غنی از آنتی بادی های اختصاصی است ودر مقایسه با متدهای گذشته، تهیه آنتی بادی از سرم پستانداران راحت تر، بهداشتی تر و مقرون به صرفه تر میباشد، به طوری که قیمت هر گرم IgY کمتر از 10 دلار است در صورتی که قیمت هر گرم IgG بیشتر از 20000 دلار می باشد. همچنین تولید و استفاده از این آنتی بادی سازگار با قوانین جدید محافظت از حیوانات است و بر خلاف آنتی بیوتیک ها، سازگار با طبیعت است و تاثیرات جانبی نامطلوب، بقایای سمی و ایجاد مقاومت به بیماری ها را ندارد. این ویژگی ها اجازه کاربردهای جدید IgY را در زمینه های پزشکی پ، بهداشت عمومی و درمان های دامپزشکی و امنیت غذایی می دهد.
از نظر ساختار و عملکرد در ابتدا به نظر می رسید که آنتی بادی IgY مشابه ایمنوگلوبولین IgG باشد. در حالی که در حال حاضر این نظریه وجود دارد که IgY جد تکاملی IgG، IgE و IgM پستانداران است. ساختار کلی مولکول IgY مشابه مولکول IgG با دو زنجیر سنگین و دو زنجیر سبک می باشد، اما IgY دارای وزن مولکولی 180 کیلو دالتون بالاتر از IgG است. وزن مولکولی زنجیر سنگین IgY بیشتر از نوع پستانداری آن می¬باشد. وزن بالاتر مولکول IgY به دلیل افزایش نواحی پایدار و زنجیرهای کربوهیدرات است. ناحیه لولا مانند IgY انعطاف پذیری کمتری نسبت به IgG دارد و بنابراین به نظر می رسد که IgY هیدروفوبیک تر از IgG باشد و در نهایت نقطه ایزوالکتریک IgY 6/7-7/5 : PH و IgG 5/8- 1/6 می باشد. پایداری IgY هنگام نگهداری تحت بعضی از شرایط مناسب است. IgY محلول را شاید بتوان در دمای 4 درجه سانتی گراد برای ماه ها و تا چند سال نگه داری کرد. IgY خشک را می توان برای 5 تا 10 سال بدون کاهش فعالیت در دمای 4 درجه و برای مدت 6 ماه در دمای اتاق نگه داری کرد. در صورتی که در حالت لیوفیلیزه رشد باکتری ها حداقل و ساختار IgY بهتر حفظ می شود و روشی مقرون به صرفه میباشد. این ویژگی های بیولوژیکی نیز IgY را در یک سیستم موثر ضد میکروبی و یک عامل ایمنی درمانی کرده است.